В лабораторных условиях исследованы бактериостатические и минимальная бактерицидная концентрации средства «Вироцид» с использованием тест-микроорганизмов 1,2 групп устойчивости, снижение активности дезинфицирующего средства в присутствии высокосолекулярного действия при обеззараживания контаминированных вирусом АЧС поверхностей, имитирующих объекты животноводческих помещений, с подтверждением полноты инактивации вируса поставкой биопробы на восприимчивых животных.
ВВЕДЕНИЕ
В системе санитарных, противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий, обеспечивающих благополучие страны по инфекционным болезням, повышение продуктивности животных и санитарное качество продуктов, сырья и кормов животного происхождения, дезинфекция занимает одно из важных мест. Под дезинфекцией понимают уничтожение на объектах внешней среды или удаление из них патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Основное назначение дезинфекции – разорвать эпизоотическую цепь путем воздействия на ее важнейшее звено – фактор передачи возбудителя болезни от источника инфекции к восприимчивому организму.
В последние годы на рынке дезинфицирующих средств представлен весьма большой ассортимент препаратов как отечественного, так и зарубежного производства, но при всем многообразии дезинфицирующих средств, количество компонентов, входящих в их состав, весьма ограничено, причем целый ряд соединений обладает высокой бактерио- и вирусстатической активностями и низким бактерицидным и вирулицидным действием, что не позволяет им эффективно обеззараживать контаминированные поверхности, особенно загрязненные органическими веществами. Особую актуальность проблема внедрения новых высокоэффективных дезинфектантов приобрела в последние 3 года, в связи с продолжающимся распространением по территории РФ занесенной в 2007 году африканской чумы свиней, представляющей реальную угрозу свиноводству страны. Так как при АЧС отсутствуют средства специфической профилактики, а, как показал анализ эпизоотических вспышек болезни, ведущую роль в их возникновении играет человек – зараженное мясо перевозится различными видами транспорта из одного региона в другой, очевидно, что в предотвращении дальнейшего распространения болезни одним из важнейших мероприятий является проведение дезинфекции. Учитывая биологические особенности вируса и то, что для большинства дезинфектантов не изучена их вирулицидная активность в отношении вируса АЧС, целесообразно проведение работ по обеспечению ветеринарной дезинфекционной практики новыми высокоэффективными дезсредствами.
Одним из перспективных дезинфектантов является средство «Вироцид», основные действующие вещества которого четвертично-аммониевые соединения и глутаровый альдегид. Ранее было установлено, что «Вироцид» обладает широким спектром бактерицидного и вирулицидного действия в отношении микроорганизмов различных групп устойчивости, включая спорообразующие. «Вироцид» эффективен при агрессивных факторах окружающей среды, таких как ультрафиолетовое излучение, присутствие солей в воде, придающих жесткость (до 400 мг/л солей кальция) и на поверхностях с остаточным органическими загрязнениями. Вироцид при этом является рН нейтральным, т.е. не агрессивен для чувствительных материалов транспорта и оборудования, щадящее относится к обрабатываемым поверхностям, высоко стабилен и биобезопасен в применении. Температурный диапазон « Вироцида» от 5 до 800 С (с антифризовой добавкой и до -200С) при длительности действия препарата до 7 суток.
Таким образом, учитывая наличие пористых поверхностей в помещениях для содержание свиней, остаточных загрязнений на дезинфицируемых площадях и, зачастую, высокое содержание миниральных солей в воде, используемой для приготовления рабочих растворов, для пополнения арсенала практикующих ветеринарных специалистов эффективными дезсредствами целесообразно проведение испытаний дезинфицирующей активности средства «Вироцид» в отношении вируса АЧС.
1.ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ
Образец дезинфицирующего средства «Вироцид» производства СИД ЛАЙНС НВ/СА (Бельгия).
2. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЙ
Определить спектр антимикробного действия средства «Вироцид» в отношении тест-микроорганизмов 1, 2 групп устойчивости.
Определить дезинфицирующую активность средства «Вироцид» в отношении вирулентного штамма вируса африканской чумы свиней (АЧС) на контаминированных вирусом поверхностях, имитирующих объекты животноводческих помещений.
3.ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Испытания проводили в период с 28 апреля 2011 г по 30 июня 2011 года в соответствии с «Методами испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности», утвержденными Главным государственным санитарным врачом РФ, М., 1998 г, «Методическими указаниями о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики», утвержденными ГУВ Госагропрома СССР в 1987 г, с использованием биопробы и «Методическими указаниями по отбору, оценке и испытаниям антивирусного и антибактериального действия химических соединений» М., 2004 г.
4. ОЦЕНИВАЕМЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Инфекционная активность вируса АЧС изолят Ставрополь в первичной культуре клеток костного мозга свиней.
Минимальные бактериостатическая и бактерицидная концентрации средства «Вироцид».
Токсичность (МИД) средства «Вироцид» для первичной культуры клеток костного мозга свиней (ККМС).
Дезинфицирующее действие средства «Вироцид» производства СИД ЛАЙНС НВ/СА (Бельгия) на вирус АЧС в культуре ККМС с использованием тест-объектов из впитывающего (бетон) и не впитывающего (полимерное покрытие) материалов.
Дезинфицирующее действие средства «Вироцид» производства СИД ЛАЙНС НВ/СА (Бельгия) на вирус АЧС с использованием тест-объектов (бетон) и постановкой биопробы на подсвинках массой 18-25 кг.
5.МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЙ
5.1. Получение культур тест-микроорганизмов
В пробирки со скошенным триптон-соевым агаром засевают предварительно проверенные на отсутствие посторонней контаминации бактериальной и грибной микрофлорой культуры тест-микроорганизмов (Escherichia coli и Staphylococcus aureus) в посевной дозе 103-106/мл. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 18-20 ч. Суточные культуры контролируют на отсутствие контаминаитов. Для этой цели из полученных культур готовят мазки, окрашивают по Граму и подвергают световой микроскопии. Затем агаровые культуры смывают физиологическим раствором.
5.2. Определение бактерицидной и бактериостатической активности методом серийных разведений.
Для определения минимальной бактерицидной концентрации средства «Вироцид» готовили его серийные двукратные разведения на мясо- пептонном бульоне (МПБ) от 0,5 % до 0,0009% в объеме 2,0 мл.
При приготовлении заражающей суспензии определяли исходную концентрацию бактериальных клеток в смывах с агаровых культур тест- микроорганизмов (Е. coli штамм 0:157 и S. aureus штамм 209-Р) с использованием стандарта мутности, после чего готовили рабочее разведение инокулюма в концентрации 1 х 107 м.к./мл.
В приготовленные разведения средства вносили инокулюм одной из культур в объеме 0,2 мл и инкубировали при температуре 370С.
Результаты учитывали визуально через 18-20 часов инкубации при 37°С по появлению роста культуры в пробирках (бактериостатическое действие).
Контролем служили бульонные культуры микроорганизмов, в которые препарат не вносился.
Бактерицидное действие средства изучали по окончании исследований по определению бактериостатического действия. Для этого из пробирок, в которых видимый рост отсутствовал, по 0,2 мл высевали на МПА. Посевы продолжали инкубировать при 37°С и через 5 суток повторяли процедуру пересева на МПА. Пересевы инкубировали при 37°С в течение 18-24 часов, после чего проводили учет результатов.
Минимальной бактерицидной дозой является та доза средства, при которой отсутствовал рост микроорганизма на МПА.
Для изучения влияния высокомолекулярного белка на антимикробную активность проводили аналогичные испытания с добавлением в МПБ нормальной сыворотки крови лошади в конечной концентрации 40 %.
5.3. Определение инфекционной активности вируса АЧС в культуре клеток.
Для определения инфекционной активности вируса АЧС готовили его десятикратные разведения, которые вносили в культуральные матрасы с ККМС. Продолжительность инкубации 7 дней. В контрольные культуральные матрасы с ККМС вируссодержащая жидкость не вносилась.
5.4. Оценка токсичности средства «Вироцид» для культуры клеток.
Для определения максимально-переносимой дозы средства «Вироцид» готовили его двукратные разведения, которые вносили в культуральные матрасы с культурой ККМС. Продолжительность инкубации 7 дней. В контрольные культуральные матрасы с ККМС средство не вносили.
За МПД принимали высшую концентрацию препарата, которая не вызывала изменений культуры клеток.
5.5. Оценка дезинфицирующего действия средства «Вироцид» in vitro и in vivo.
При исследованиях с вирусом, использовали вирулентный вирус АЧС. На стерильные тест-объекты, имитирующие объекты животноводческих помещений из бетона и полипропилена наносили по 1,5 мл вируссодержащей жидкости на 100 см2. В качестве механической защиты вируса использовали стерильный свиной навоз в количестве 0,3 г. сухого вещества на 100 см2 поверхности, что составило 20% органических веществ в вируссодержащей жидкости. Перед нанесением на поверхность в вируссодержащую суспензию тщательно перемешивали с соответствующим количеством навоза. Смесь равномерно распределяли на поверхности тестов, после чего их подсушивали 1-2 часа. Испытуемые 0,25-2,0 %-ные растворы средства «Вироцид» равномерно наносили методом орошения на тест-объекты, из расчета 0,3 л/м2 площади.
На контрольные тест-объекты, вместо раствора средства «Вироцид» наносили такое же количество водопроводной воды, которая использовалась для приготовления раствора средства.
С обработанных растворами дезинфектанта тесг-объектов, испытуемые материалы отбирали через 0,5-3,0 часа. Вирусный материал соскабливали, добавляли по 4,5 мл среды Хенкса, экстрагировали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугировали 15 минут при 3000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость сразу использовали для заражения культуры ККМС с последующими двумя пассажами, а также для постановки биопробы на подсвинках. Биопробу проводили на 20 животных: 18 – опытных и 2 – контрольных.
Наблюдение за культурой клеток вели в течение 14 дней с учетом двух последовательных пассажей, а за заражёнными подсвинками — в течение 21 суток.
Опыты сопровождались следующими контролями:
– определение инфекционного титра в вируссодержащем материале;
– снижение титра инфекционности вируса в результате обработки инфицированных поверхностей водой.
6. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ
Антимикробную активность средства «Вироцид» изучали в жидких и на твердых питательных средах с возбудителями колибактериоза и стафилококкоза с использованием белковой нагрузки и без нее.
Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли методом серийных разведений в МПБ с последующим высевом на МПА на чашках Петри.
В таблице 1 представлены результаты изучения бактериостатического и бактерицидного действия средства «Вироцид».
Тест- микроорг.
Вид действия
Белковая защита
Концентрация средства, % от исходного 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Е. coli Бактерио статич.
нет – – – – – – – – – + есть – – – – – + + + + + Бактери цидн.
нет – – – – – – – – – + есть – – – – – + + + + + S. aureus Бактерио статич.
нет – – – – – – – – – + есть – – – – – – – – – + Бактери цидн.
нет – – – – – – – – – + есть – – – – – – – – + + Примечание: 1 – 0,5 %; 2 – 0,25 %, 3 – 0,125; 4 – 0,0625; 5 – 0,0312; 6 – 0,0156; 7 – 0,0078, 8 – 0,0039; 9 – 0,0019, 10 – 0,0009; – – роста нет; + – рост есть
В результате проведенных испытаний установлено, что средство «Вироцид» обладает выраженной антимикробной активностью в отношении тест-культур грамположительных (S. aureus) и грамотрицательных (Е. coli) микроорганизмов обеспечивая их инактивацию при концентрациях 0,0019 % от исходной (таблица 1). При добавлении высокомолекулярного белка происходит снижение бактерицидной активности.
При определении инфекционной активности вируса АЧС изолят Ставрополь в виде вирус-крови установлено, что титр вируса в культуре ККМС составляет 7,00 lg ГАЕ50/мл (гемадсорбирующих единиц).
Данные по оценке токсичности средства «Вироцид» для культуры клеток костного мозга свиней представлены в таблице 2.
Таблица 2. Оценка токсичности средства «Вироцид» для культуры клеток костного мозга свиней.
Наименование препарата
Конц- я, % Культура клеток
Срок наблюдения (суг) 1 2 3 4 5 6 7 «Вироцид» 2,0 ККМС + + + + + + + 1,0 + + + + + + + 0,5 – – – + + + + 0,25 – – – – – + + 0,125 – – – – – – –
Примечание: «-» – отсутствие дегенерации монослоя клеток; «+» – наличие дегенерации. Как видно из представленных в таблице 2 данных средство «Вироцид» в концентрациях 0,125% и ниже не токсичен для культуры клеток костного мозга свиней, в течение 7 суток наблюдения.
Результаты испытаний дезинфицирующего действия средства «Вироцид» в культуре ККМС представлены в таблице 3.
Из данных, представленных в таблице 3 видно, что средство «Вироцид» в концентрации 0,5 %, экспозиции 30 минут и норме расхода 0,3 л/м2 полностью инактивирует вирус АЧС на невпитывающих и частично — на впитывающих тест-поверхностях. В концентрации 0,5 % и экспозиции 1,0 час, а также 1,0% и экспозиции 30 минут с нормой расхода 0,3 л/м средство обеззараживает контаминированные вирусом АЧС опытные тест-поверхности из не впитывающих и впитывающих материалов с белковой защитой в виде свиного навоза при испытаниях в культуре ККМС.
Таблица 3 Определение в культуре ККМС дезинфицирующего действия средства «Вироцид» при обеззараживании тест-объектов, контаминированных вирусом АЧС.
Концентрация действующего вещества, % Норма расхода,
л/м2
Экспозиция, час
Полипропилен Бетон 0,25 0,3 0,5 +/+/ + +/ +/ + 1,0 -/-/ + +/ +/ + 0.5 0,3 0,5 -/-/ – +/+/+ 1,0 -/-/ – -/-/ –
1,0 0,3 0,5 -/-/ – -/-/ – 1,0 -/-/ –
-/-/ – 2,0 0,3 0,5 -/-/ – -/-/ – 1,0 -/-/ – -/-/ – Контроль 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 +/+/+ +/+/+
Примечание: + – означает наличие вируса АЧС; – – означает отсутствие вируса.
Результаты испытаний дезинфицирующего действия средства «Вироцид» в отношении вируса АЧС с использованием биопробы представлены в таблице4.
Таблица 4 Определение в биопробе дезинфицирующего действия средства«Вироцид» при обеззараживании тест-объектов из бетона, контаминированных вирусом АЧС.
№ п/п Конц-я раствора по препарат)’, % Норма расхода,
л/м2
Экспозиц ия, час Тест-поверхности Бетон пало/всего 1 0,5 0,3 1,0 3/3 2 1,0 0,3 0,5 3/3 3 0,3 1,0 3/3 4 0,3 3,0 1/3 5 0,5 3,0 0/3 6 2,0 0,3 1,0 0/3 7 Контроль 2/2 Из данных таблицы 4 видно, что при орошении средством «Вироцид» тест-объектов, контаминированных вирусом АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, поверхности из бетона были обеззаражены 2,0 %-ным раствором при экспозиции 1 час и норме расхода 0,3 л/м2 и 1,0% -ным раствором при экспозиции 3 часа и норме расхода 0,5 л/м2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Дезинфектант «Вироцид» по результатам лабораторных исследований обладает выраженной бактерицидной и бактериостатической активностями в отношении тест-культур грамположительных (S. aureus) и грамотрицательных (Е. coli) микроорганизмов обеспечивая их инактивацию при концентрациях 0,0019 % от исходной
На основании проведенных исследований в культуре клеток костного мозга свиней (in vitro) установлено, что полное обеззараживание впитывающих и невпитывающих тест-поверхностей, имитирующих объекты животноводческих помещений, контаминированных вирулентным эпизоотическим изолятом вируса АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, было достигнуто при однократном орошении 0,5 %-ным раствором средства «Вироцид» с экспозицией 1 час и 1,0%-ным раствором средства при экспозиции 30 минут с нормой расхода 0,3 л/м2. Это свидетельствует о высокой вирулицидной активности дезинфектанта «Вироиид»в отношении вируса АЧС.
При испытаниях на сельскохозяйственных животных (биопроба) установлено, что полное обеззараживание тест-поверхностей (бетон), имитирующих объекты животноводческих помещений и контаминированных вирулентным эпизоотическим изолятом вируса АЧС с белковой защитой в виде свиного навоза, было достигнуто при однократном орошении 1,0 %-ным раствором дезинфектанта «Вироцид» при норме расхода 0,5 л/м2 с экспозицией 3 часа и 2,0 %-ным раствором средства «Вироцид» при расходе 0,3 л/м2 и экспозиции 1 час.
Таким образом, дезинфицирующий препарат «Вироцид» обладает выраженным вирулицидным действием и рекомендуется для применения в очагах заражения АЧС для обработки объектов ветеринарного надзора в соответствии с «Правилами проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора», утвержденными
Департаментом ветеринарии МСХ РФ 16.07.2002г. с целью полной инактивации вируса АЧС и предотвращения его распространения